ARN de interferencia

Actualmente, el siRNA (RNA de interferencia), se ha convertido en una herramienta bastante útil para analizar las diversas funciones de genes eucarióticos convirtiéndose también en un posible sistema terapéutico.

Este tipo de ácido nucleico consiste en una doble cadena de RNA complementaria, la cual mediante un proceso de activación post-transcripcional, es capaz de silenciar secuencias específicas de ciertos genes.

Las largas cadenas de dsRNA son cortadas por una RNasa de tipo III denominada Dicer, en fragmentos de 19 a 23 nucleótidos cuyo extremo 5’ se encuentra fosforilado, además de poseer dos nt desemparejados en cada extremo 3’. Ahora este tipo de RNA pasa a denominarse siRNA, el cual es desenrollado por una endonucleasa (Ago 2). A continuación, la hebra diana es incorporada en el complejo RISC (Interference Specificity Complex). Este complejo usa a la hebra en el reconocimiento del mRNA complementario. Una vez producido, se lleva a cabo el corte del mismo bloqueando de esta manera la expresión del correspondiente gen.

A pesar de que los dsRNA se encargan de bloquear la expresión de determinados genes, estudios pioneros en células de mamíferos no fueron del todo satisfactorios. Estos usaban largas cadenas de dsRNA las cuales en vez de ser activadas y dar lugar a RNAi (RNA de interferencia), lo que ocurría era que se generaba una disminución de mRNA conduciendo eventualmente a la apoptosis de la célula. Más tarde se demostró que este problema podía ser solventado gracias a la síntesis química de dsRNAs de 19 a 23 nt. Al transfectar con estos siRNAs resultaba una fuerte supresión del gen en distintas líneas celulares de mamíferos. Sin embargo, uno de los inconvenientes del uso de esta tecnología es que resulta demasiado caro, se necesita transfectar las células y todo ello para conseguir finalmente solo una supresión transitoria debido a su corta vida.

Para solucionar estas limitaciones, InvivoGen ha diseñado un sistema eficiente denominado psiRNA™, el cual permite la generación del siRNA dentro de las células. Este sistema consiste en un plásmido que produce pequeñas horquillas de RNAs (shRNAs). En él se puede llegar a introducir fragmentos de DNA de hasta 50 nt y la RNA polimerasa humana 7SK se encarga de generar los shRNAs. Estos tipos de ácidos nucleicos son mucho más estables que los siRNAs sintéticos y gracias a ello permiten que el silenciamiento de los genes sea más duradero.

Hay que tener en cuenta además que el que se consiga un buen silenciamiento depende en gran parte del diseño del shRNA. Para ello InvivoGen ha construido un algoritmo llamado siRNA Wizard el cual identifica secuencias shRNA para un determinado gen. La elección de estas secuencias se encuentra fundamentada en la estabilidad termodinámica y ésta a su vez en la composición y en la estructura secundaria (www.sirnawizard.com).

Para la búsqueda de shRNA se puede realizar mediante dos métodos:

–          Búsqueda estándar: utiliza un conjunto predeterminado de criterios para analizar el gen de interés y ofrece las mejores secuencias para silenciar.

–          Búsqueda avanzada: le permite configurar manualmente los criterios para la selección de las secuencias en contra de su objetivo de genes.

Una vez seleccionada la secuencia de shRNA, la herramienta de inserción de horquilla le permite diseñar dos oligonucleótidos complementarios que forman la inserción para completar el vector psiRNA. Esta herramienta le permite además generar un control negativo.

psiRNA-h7SKNA

• Consiste en una familia de vectores de expresión diseñada para la generación de shRNA gracias al promotor humano 7SK RNA polymerase III (Pol III). Gracias a una serie de experimentos se comprobó la fortaleza de los distintos promotores humanos: 7SK, H1 y U6. De esta manera se encontró que el mayor silenciamiento se conseguía con el primero de ellos. Además, este promotor puede ser usado en combinación con otros para múltiples shRNAs en estrategias de expresión tanto in vivo como in vitro.

• Este tipo de plásmido ofrece dos estrategias de clonaje: Acc 65I / Hind III ó Bbs I / Bbs I. Aunque este último sitio de corte sea reconocido por la misma de restricción, son sitios distintos por lo que la autoligación nunca se produciría.

• Posee un sistema de selección para los clones recombinantes ya que los sitios de clonación se encuentran flanqueados por el péptido bacteriano LacZ. De tal manera que se puede discriminar entre las células parentales, azules y los recombinantes blancos. Sin embargo, es necesario secuenciar en las colonias blancas el inserto ya que una variación en una sola base podría generar un shRNA inactivo.

• Está disponible con varios marcadores seleccionables para funcionar tanto en E.Coli como en células de mamíferos.

• psiRNA-h7SKGFPzeo: se caracteriza por la combinación del gen GFP (Green Fluorescent Protein) y el gen de resistencia a Zeocin™. Esto permite la evaluación de la transfección gracias a la determinación del porcentaje de células transfectadas al medir la actividad del reporter.

• psiRNA-DUO

• Se trata de un plásmido capaz de producir dos shRNAs para el silenciamiento de dos genes dianas distintos o de un solo gen con o sin polimorfismos.
• Posee dos lugares de unión para la RNA Pol III y el gen fusión GFP-Zeo.

• EL primer lugar de unión está formado por:

  –          Promotor humano 7SK.

  –          Sitio de corte: Acc65 I / Hind III.

  –          Sistema de selección azul / blanco gracias a la presencia del péptido LacZ.

  El segundo lugar de unión está formado por:

  –          Promotor humano 7SK.

  –          Sitio de corte: Bbs I / Bbs I.

  –          Sistema de selección azul / blanco gracias a la presencia del péptido GUS.

• Gen GFP-Zeo es una fusión transcripcional entre el gen GFP (Green Fluorescent Protein) y el gen de resistencia a Zeocin™ (ZeoR). Estos dos genes se encuentran separados por el promotor bacteriano (EC2K) localizado dentro de un intrón. El promotor CMV conduce la expresión del gen GFP-Zeo permitiendo así el seguimiento de la eficacia de la transfección y la selección de clones estables.

• psiTEST^TM System

• Consiste en un sistema que te permite medir la eficacia de tu shRNA / siRNA sin perder una gran cantidad de tiempo ni de dinero. La eficiencia se mide gracias a la reducción en la expresión del gen alcalina fosfatasa (SEAP), el cual se fusiona con nuestro gen diana en 3’ después de un codon de stop perteneciente al MCS.
• Posee también Gen GFP-Zeo, lo cual permite amplificar el plásmido en E. coli y seleccionar los clones de mamífero estables, mientras que el resto de GFP permite el seguimiento de la eficacia de transfección.
• Se puede utilizar para clonar fragmentos de genes o genes enteros, el tamaño óptimo siendo 1,5 kb, si bien los genes de hasta 3,5 kb se pueden dirigir.