CRISPR 2

En el 2005, tres grupos de investigación independientes mostraron que algunos de los espaciadores de los CRISPRs se derivan de diversas fuentes de ADN como ADN de fagos y ADN extracromosomal como los plásmidos.^19 20 Nuevamente fue el grupo de Francisco J. Mojica quien primero se dio cuenta que las secuencias CRISPR y los espaciadores asociados podían formar parte de algún sistema inmune propio de estos microorganismos procarióticos, quien primero estableció la relación entre CRISPR e inmunidad²¹ . Esas observaciones clave indican que el sistema CRISPR/cas puede tener un rol en la inmunidad adaptativa en las bacterias.¹ Koonin y sus asociados²² propusieron que los espaciadores sirven como plantilla para moléculas de ARN, análogo a un sistema que usan los eucariontes llamado interferencia por ARN.

En 2007 Barrangou, Horvath (científicos de la industria alimenticia en Danisco) y el grupo de Moineau en la Université Laval (Canadá) mostraron que podían alterar la resistencia de Streptococcus thermophilus a ataques de fagos con ADN espaciador.²²

Jennifer Doudna y Emmanuelle Charpentier habían estado explorando de manera independiente a las proteínas asociadas a CRISPR para aprender cómo las bacterias utilizan a los espaciadores en sus sistemas inmunes. Juntas, estudiaron un sistema CRISPR más simple que se basa en una proteína llamada Cas9. Encontraron que las bacterias responden ante un fago invasor al transcribir espaciadores y ADN palindrómico en una larga molécula de ARN y que entonces la célula utilizaba un ARN llamado Trans-activating crRNA (tracrRNA) y también Cas9 para cortarla en pedazos llamados ARNcr.²²

Cas9 es una nucleasa, una enzima especializada en cortar ADN, con dos sitios de corte activos (HNH and RuvC), uno para cada hebra de la doble hélice. El equipo demostró que podrían desactivar uno o ambos sitios preservando la habilidad de Cas9 de ser específico para su ADN objetivo. Jinek combinó al tracrRNA y ARN espaciador para formar una molécula llamada single-guide RNA que, al combinarse con Cas9, podía encontrar y cortar los blancos correctos de ADN. Jinek propuso que estos ARN guía sintéticos podrían usarse para la edición de genes.²²

La primera vez que se mostró que CRISPR funcionaba como una herramienta de ingeniería genética en cultivos de células humanas fue en 2012.^23 24 Desde entonces se ha utilizado en muchos organismos, incluida la levadura del pan (Saccharomyces cerevisiae),²⁵ pez cebra (Danio rerio),²⁶ mosca de la fruta (Drosophila melanogaster),²⁷nematodos (Caenorhabditis elegans)²⁸ plantas²⁹ y ratones,³⁰ entre otros.

Adicionalmente, CRISPR ha sido modificada para hacer factores de transcripción programables que permiten a los científicos silenciar o activar ciertos genes.³¹

Existen ahora librerías con decenas de miles de ARN guía.²²

La primera evidencia de que CRISPR puede revertir síntomas de enfermedad en organismos vivos fue demostrada en marzo de 2014, cuando investigadores del MIT curaron a ratones de desórdenes genéticos del hígado.³²

Estructura del locus

Los loci de CRISPR van de 24 a 48 pares de bases.³⁴ Los repetidos están separados por espaciadores de longitud similar.³⁴ Algunas secuencias espaciadoras de CRISPR son complementarias a las de los plásmidos y fagos,^19 21 20 aunque algunos espaciadores se complementan con el genoma procarionte (espaciadores autoreplicativos).^19 35 Pueden añadirse rápidamente espaciadores nuevos como respuesta a una infección por un fago.³⁶

Los genes asociados a CRISPR, llamados cas, son genes frecuentemente relacionados con los arreglos de repetidos CRISPR. Análisis extensivos de genómica comparativa han identificado a muchos genes cas diferentes; un análisis inicial de 40 genomas de bacterias y arqueas sugirió que podría haber 45 familias de genes cas, con sólo dos genes, cas1 y cas2, siendo omnipresentes.³⁴ El sistema actual de clasificación de CRISPR agrupa a los operones en cas en tres grupos mayores, cada uno con múltiples subdivisiones basadas en filogenia de cas1 y en el complemento del operón del gen cas.³⁷ Aparte de cas1 y cas2, las tres divisiones mayores tienen conjuntos muy diferentes de genes constitutivos, con cada una de las divisiones conteniendo un ‘gen característico’ encontrado exclusivamente en esa subdivisión. Muchos organismos contienen múltiples sistemas CRISPR-Cas sugiriendo que son compatibles e incluso podrían compartir elementos.³⁸ La distribución esporádica de los subtipos de CRISPR/Cas sugiere que el sistema está sujeto a la transferencia genética horizontal durante la evolución microbiana.