CRISPR 3

Adquisición de los espaciadores dentro de los locus de los CRISPR

Capturar al ADN invasor e integrarlo en un locus CRISPR en forma de un espaciador es la primera etapa en la respuesta inmune. La prevalencia de cas1 y cas2 fue la primera pista de que estaban involucrados en la adquisición de los espaciadores ya que todos los CRISPRs comparten la estructura repetitiva regular. Estudios de mutaciones confirmaron esta hipótesis ya que al remover cas1 o cas2 impedía la adquisición de espaciadores, sin afectar la respuesta inmune CRISPR en sí.^{40 44 45 46 47} La función exacta de Cas1 y Cas2 se desconoce, sin embargo un número de proteínas Cas1 se han caracterizado bioquímicamente y se han resuelto sus estructuras.^48 49 50 Las proteínas Cas1 tienen secuencias de aminoácidos muy diversas, sin embargo sus estructuras cristalinas son sorprendentemente similares y todas las cas1 purificadas son nucleasas dependientes de metales que se unen a ADN en modo indpendiente de secuencia.³⁸ Las proteínas Cas2 representativas también han sido caracterizadas y poseen actividad específica de endoribonucleasa ya sea para ARN de cadena sencilla o ADN de cadena doble^51 52 53 Los datos funcionales y estudios de mutación genética sugieren que Cas1 y Cas2 cortan fragmentos de ADN invasor y los insertan en arreglos CRISPR.

El análisis bioinformático de regiones de genomas de fagos que fueron cortados como espaciadores (denominados protoespaciadores) reveló que éstos no estaban distribuidos aleatoriamente en sino más bien se econtraban adyacentes a secuencias cortas de ADN (de 3 a 5 pb) llamadas PAMs (protospacer adjacent motifs en inglés)⁵⁴ . El análisis de los sistemas CRISPR-Cas de las tres divisiones mayores han mostrado que los PAms son importantes para los sistemas tipo I y II, pero no para el III durante el proceso de adqusición de espaciadores.^{20 55 56 54 57 58} En sistemas tipo I y II, los protoespaciadores se cortan es posiciones adyacentes a una secuencia PAM, con el otro extremo del espaciador siendo cortado con un mecanismo tipo regla inherente a la proteína Cas1, manteniendo así la regularidad en tamaño de los espaciadores a lo largo del arreglo de CRISPR.^59 60 La conservación de la secuencia PAM difiere entre los sistemas CRISPR-Cas y parece estar ligado evolutivamente a cas1 y a la secuencia líder.^58 61

Los nuevos espaciadores se añaden a un arreglo de CRISPR en un modo direccional,¹⁹ocurriendo preferencialmente^{55 56 62 36 63} pero no exclusivamente, adyancentes^57 60 a la secuencia líder. El análisis del sistema tipo I-E de E. coli ha demostrado que el primer repetido directo, adyacente a la secuencia líder, es copiado, con el espaciador recientemente adquirido siendo insertado entre el primer y segundo repetidos directos.^46 59La secuencia PAM también parece ser importante durante la inserción de espaciadores den sistemas tipo I-E. La secuencia PAM del sistema I-E contiene un nucleótido final fuertemente conservado (adyacente al primer nucleótido del protoespaciador) y se ha mostrado que este nucleótido se convierte en la base final en el primer repetido directo.^4764 65 Esto sugiere que la maquinaria de adquisición de espaciadores genera overhangs de cadena sencilla en la penúltima posición del repetido directo y en el PAM durante la inserción del espaciador. Sin embargo no todos los sistemas CRISPR-Cas parecen tener este mecanismo ya que los PAMs caracterizados en otros organismos no muestran el mismo nivel de conservación en la posición final.⁶¹ Es probable que en esos sistemas, un extremo romo es generado al final del repetido directo y el protoespaciador durante la adquisición. Análisis reciente de CRISPRs de Sulfolobus solfataricus han revelado más complejidades al modelo canónico de la inserción de espaciadores ya que uno de sus seis locus insertó espaciadores de manera aleatoria a lo largo de su arreglo CRISPR, opuesto a una inserción más cercana a la secuencia líder.⁶⁰

Ha sido notado en una cantidad de CRISPRs que estos contienen muchos espaciadores para el mismo fago. El mecanismo que causa este fenómeno ha sido dilucidado recientemente en el sistema tipo I-E de E. coli. Una mejora significativa en la adquisición de espaciadores ha sido detectada donde ya hay espaciadores con el fago como objetivo inclusive con "mismatches" al protoespaciador. Este ‘cebado’ requiere que tanto las proteínas Cas involucradas en adquisición como en interferencia interactúen entre sí. Los espaciadores nuevamente adquiridos que resultan del mecanismo de cebado siempre se encuentran en la misma cadena que la del espaciador original que produjo el cebado.^47 64 65 Esta observación ha llevado a la hipótesis de que la maquinaria de adquisición recorre el ADN extraño después del cebado para encontrar un nuevo protoespaciador.⁶⁵

La respuesta inmune por CRISPR ocurre en dos etapas: la biogénesis de CRISPR-ARN (ARNcr) y la interferencia guiada por ARNcr. Un arreglo de CRISPR es transcrito de un promotor en el líder en un sólo transcrito largo.^40 66 67 Este transcrito es procesado por cortes dentro de las secuencias repetidas para formar ARNcr. Los mecanismos para producir ARNcr maduros varían de gran manera entre los tres sistemas principales de CRISPR-Cas. Tanto en sistemas del tipo I-E como I-F las proteínas Cas6e y Cas6f respectivamente, reconocen giros^68 69 70 creados por la naturaleza palindrómica de los repetidos directos.⁷¹ Esas proteínas cortan el transcrito primario en la unión entre los ARN de cadena sencilla y doble, dejando un extremo 5ʹ de 8 nucleótidos originado del repetido en los ARNcr maduros y con una secuencia espaciadora. Los sistemas tipo III también utilizan Cas6, sin embargo los repetidos encontrados en sistemas de tipo III no producen giros, sino que los cortes ocurren por el "enroscamiento" del transcrito primario a lo largo de la Cas6 para permitar corte to allow cleavage de 8 nucleótidos río arriba de la unición de los espaciadores repetidos.^72 73 74 Los sistemas tipo II no poseen el gen Cas6 así que utilizan a la ARNsaIII para hacer los cortes. Los sistemas funcionales tipo II codifican un pequeño ARN adicional que es complementario a la secuencia de los repetidos conocido como ARN trans-activador(tracrRNA).⁴⁴ La transcripción del tracrRNA y del transcrito primario CRISPR resulta en apareamiento de bases u la formación de ARN de doble cadena en la secencia de repetidos, la cual es subsecuentemente cortada por la ARNasaIII para producir ARNcr. A diferencia de los otros dos sistemas el ARNcr no contiene al espaciador completo, está truncado en un extremo por 10 nucleótidos.⁴²

Los ARNcr se asocian con las proteínas Cas para formar complejos de ribonucleótidos que reconocen ácidos nucleicos extraños. Expremientos con fagos y plásmidos han indicado que los ARNcr no tienen preferencia por cadenas codificantes o no codificantes, lo cual indica un sistema específico para ADN guiado por ARN.^{7 40 47 75 76 77 78} El complejo tipo I-E (llamado Cascade de forma común) requiere cinco proteínas Cas arregladas en una configuración que recuerda a un caballo de mar, unidas al ARNcr de cadena sencilla que estpa unido a lo largo del "lomo".^79 80 Durante el estado de interferencia en los sistemas tipo I la secuencia PAM es reconocida en la cadena complementaria al ARNcr y se requiere junto con el apareamiento de ARNcr. En los sistemas tipo I, el correcto apareamiento entre el ARNcr y los protoespaciadores señaliza un cambio conformacional en Cascade que recluta a Cas3 para la degradación del ADN.

Los sistemas de tipo II utilizan una proteína multifuncional, Cas9, para el paso de interferencia.⁴² La Cas9 requiere tanto al ARNcr como al tracrRNA para funcionar y corta al ADN usando sus dominios duales de endonucleasa: HNH y RuvC. El apareamiento de bases entre el PAM y el genoma del fago también se requiere en los sistemas tipo II, sin embargo el PAM es reconocido en la misma cadena que el ARNcr (la cadena opuesta a los sistemas tipo I).

Los sistemas tipo III, como los de tipo I, requieren un complejo multiproteico para asociarse con el ARNcr. Análisis bioquímicos y estructurales de S. solfataricus y Pyrococcus furiosus han dilucidado que seis o siete proteínas cas se unen a los ARNcr, respectivamente.^81 82 Sorpredentemente, los sistemas tipo III analizados en S. solfataricus y P. furiosus son específicos para el ARNm de fagos y plásmidos,^83 82 lo cual puede hacer a esos sistemas capaces de ser específicos para genomas de fagos basados en ARN.³⁸ El mecanismo para distinguir ADN propio del externo durante la interferencia está dentro de los ARNcr y por lo tanto se infiere que es conservado en los 3 sistemas. Aun a través del proceso de maduración distinitva de cada uno de los tipos, todos los ARNcr contienen una secuencia espaciadora y una porción del repetido en uno o ambos extremos. Es la secuencia parical de repetidos la que previene que el sistema CRISPR-Cas ataque al cromosoma ya que el apareamiento de bases más allá de la secuencia del espaciador es una señal de que pertenece así mismo y previene el corte de ADN en el cromosoma.⁸⁴ Las enzimas de CRISPR guiadas por ARN se clasifican como enzimas de restricción tipo V.