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Estudios en Streptococcus thermophilus fueron los primeros indicativos de cómo los CRISPRs mueven a la evolución de fagos y bacterias. Un espaciador CRISPR debe corresponder perfectamente a la secuencia del gen objetivo del fago. Los fagos pueden seguir infectando a sus hospederos cuando hay mutaciones puntuales en el espaciador.84 Se siguen requerimientos similares en el PAM o la cepa seguirá siendo sensible a fagos.56 84 El modelo básico de evolución CRISPR se explica como el modelo donde los espaciadores recientemente incorporados llevan a los fagos a mutar sus genomas creando diversidad en las poblaciones tanto de fagos y bacterias.
La evolución CRISPR ha sido estudiada usando la genómica comparativa de muchas cepas de S. thermophilus, Escherichia coli y Salmonella enterica. Un estudio de 124 cepas de S. thermophilus mostró que 26% de todos los espaciadores eran únicos y que los diferentes locus de CRISPR mostraban diferentes tasas de adqusición de espaciadores.55 Los resultados mostraton que un locus de CRISPR particular puede evolucionar más rápidamente que otros, lo cual ayuda a establecer relaciones filogenéticas entre cepas. Un análisis similar de cepas de E. coli y S. enterica reveló que evolucionaron mucho más lentamente que S. thermophilus. Las cepas de esta última que habían divergido hace más de 250,000 años todavía contenían el mismo complemento de espaciador.85
La diversidad de CRISPR se estudió en múltiples comunidades ambientales usando metagenómica. El análisis de los biofilms de los drenajes ácidos de dos minas mostró que uno de los CRISPRs analizados contenía deleciones y espaciadores extensivos en comparación con el otro biofilm, lo cual sugiere una mayor actividad de fagos en una comunidad que en otra.36 En la cavidad oral, un estudio temporal determinó que aproximadamente del 7 al 22% de los espaciadores eran compartidos en períodos en el tiempo a lo largo de 17 meses en un mismo individuo y menos del 2% de los espaciadores fueron compartidos entre diferentes individuos en cualquier período en el tiempo.63 Del mismo ambiente, se aisló una cepa particular usando primers de PCR específicos para su CRISPR. A diferencia de los resultados generales de la presencia/ausencia de los espaciadores, los cuales mostraban diversidad significativa, este CRISPR añadió 3 espaciadores a lo largo de 17 meses,63 lo que sugiere que incluso en un ambiente con diversidad importante de CRISPR algunos locus evolucionan lentamente. Los CRISPRs también han sido analizados desde los metagenomas producidos por el proyecto del microbioma humano.86 Aunque la mayoría de los CRISPRs eran específicos en un sitio, algunos CRISPRs dentro del sitio eran ampliamente encontrados entre individuos. Uno de esos locus de CRISPR se originó con estudios de especies de Streptococcus y contuvieron ~15,000 espaciadores, 50% de los cuales eran únicos. De modo similar a los estudios dirigidos de la cavidad oral, algunos de los CRISPRs mostraron poca evolución entre períodos en el tiempo.86
La evolución CRISPR ha sido estudiada en quimiostatos usando S. thermophilus para examinar de manera explícita la tasa de adquisición de espaciadores. En el período de una semana, cepas de S. thermophilus adquirieron hasta tres espaciadores cuando eran expuestos ante sólo un fago.87 En el mismo periodo de tiempo, el fago desarrolló varios SNPs que se quedaron fijos es la población, lo que sugiere que CRISPR había prevenido la replicación de todos los otros tipos de fagos sin estas mutaciones.87Otros exprimentos, también con S. thermophilus, mostraron que los fagos pueden infectar y replicarse en hospederos que tienen sólo un espaciador y que los hospederos sensibles existen en ambientes con altas concentraciones de fagos.88 Los estudios por quimiostatos y observaciones en los CRISPRs sugieren muchas consecuencias al resultado de la evolución de CRISPR y fagos.
Los CRISPRs están altamente distribuidos entre bacterias y arqueas37 y muestran similitudes en las secuencias,71 sin embargo su característica principal son sus espaciadores repetidos y repetidos directos. Esta característica hace a los CRISPRs fáciles de indentificar en largas secuencias de ADN, ya que el número de copias repetidas disminuye la posibilidad de una unión tipo falso positivo. En la actualidad hay tres programas utilizados para la identificación de repetidos CRISPR que buscan repetidos interespaciados en secuencias grandes: CRT,89 PILER-CR90 y CRISPRfinder.91
El análisis de los CRISPRs en los datos de metagenómica es mucho más demandante, ya que los locus de CRISPR no suelen asemblarse debido a su naturaleza repetitiva ni por variación de cepas, lo cual confunde a los algoritmos. Mientras que hay muchos genomas de referencias disponibles, la PCR se puede utilizar para amplificar arreglos de CRISPR y así analizar el contenido de los espaciadores.55 63 92 93 94 Sin embargo, este enfoque sólo dará información de CRISPRs específicamente buscados y en organismos con suficiente representación en bases de datos públicas para poder hacer el diseño de primers de PCR confiables.
El enfoque alterativo es extraer y reconstuir los arreglos de CRISPR arrays basándose en datos shotgun metagenómicos. La identificación de los arreglos de CRISPR de lecturas metagenómias es una tarea computacionalmente más difícil, particularmente con las tecnologías de secuenciación de segunda generación (como son 454, Illumina), ya que las longitudes cortas previenen que más de dos o tres unidades repetidas se presenten en una sola lectura. La identificación de CRISPR en lecturas crudas se logra usando puramente identificación denovo95 o al usar secuencias repetidas directas en arreglos CRISPR parcialmente ordenados86 como herramienta para identificar repetidos directos en lecturas individuales.
Un estudio bioinformático mostró que los CRISPRs son evolutivamente conservados y que se pueden aglomerar en tipos relacionados. Muchos muestran la posibilidad de una estructura secundaria conservada.71
A través del mecanismo CRISPR/Cas, las bacterias pueden adquirir immunidad a ciertos fagos y por ende detener la consecuente transimisión de estos fagos. Por esta razón los CRISPR/Cas se describen como un mecanismo de herencia Lamarckiano.96 Otros han investigado la coevolución de los genomas vitales y hospederos.97
Las proteínas Cas9 están altamente enriquecidas en bacterias patogénicas y comensales. La regulación mediada por CRISPR/Cas puede contribuir a la regulación de los genes endógenos bacterianos, particularmente en la interacción bacteriana con hospederos eucariontes. Por ejemplo, la proteína Cas9 de Francisella novicida usa un pequeño y único ARN asociado a CRISPR/Cas para reprimir un transcrito endógeno que codifica para una lipoproteína bacteriana que es crítica para F. novicida para reducir la respuesta del hospedero y promover la virulencia.98
La prueba que demostró el principio de la redirección específica del sistema CRISPR/Cas llegó en 201299 y fue un primer paso para la materialización de propuestas para la biotecnología derivada de CRISPR:100
Después de cultivar precursores de células sanguíneas llamados hemocitoblastos de la médula ósea de un paciente, la cirugía genética con CRISPR podría corregir el gen defectuoso. Entonces las células con el genoma corregido serían reintroducidas a la médula del paciente, que ahora producirá células sanas. Reemplazar el 70% de las células defectuosas significaría tener una cura.33
Antes de que pueda usarse clínicamente, la compañía debe poder garantizar que sólo la región objetivo será afectada y debe determinar cómo entregar la terapia a las células del paciente.105
Otras patologías que se podrían tratar con CRISPR incluyen la enfermedad de Huntington, los efectos de la vejez, esquizofrenia y autismo e inclusive la modificación de ADN en embriones vivos.33
Mejorar el sistema de dirección es fundamental antes de que CRISPR pueda ser utilizado en aplicaciones médicas. Los ARN guía existentes podrían trabajar sobre secuencias que difieren en algunas pares de bases de la secuencia objetivo.22
En 2014, investigadores de la UCSF usaron a los CRISPR para crear versiones sanas de células madre de pacientes con beta-talasemia.106
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